jueves, 22 de abril de 2010

pruebas bioquimicas

*Fermentan con producción de ácido y gas, la lactosa y un gran número de hidrocarbonatos.
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Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.
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Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.

*Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de multiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio

Inoculación de pruebas bioquímicas: apartir de un cultivo fresco de la cepa bacteriana (18 – 24 hrs.) se toma una muestra de una colonia con un asa en punta y se procede a inocular diversos medios de cultivo sólido de acuerdo al protocolo específico establecido para cada ensayo experimental.

En el caso de las pruebas bioquímicas de tipo líquido (caldo rojo de metilo y caldo lactosa rojo de fenol), estas se inoculan a partir de un cultivo bacteriano en caldo.


Incubación de las muestras: todos los tubos de ensayo inoculados seincuban a 37ºC por tiempos variables, dependiendo de la especificación de cada uno de los test bioquímicos utilizados.

Ejemplo de inoculación en medio sólido:

La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.
 Procedimiento:
Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.
 Resultados:
 (+)Klebsiella spp.
 ( - ) Escherichia Coli.

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.
 Procedimiento:

Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.
 Resultados:
 (+) Escherichia coli
 ( - ) Klebsiella pneumoniae

Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.
 Procedimiento:

Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.
Resultados:

En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.
 Procedimiento:
 Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un color rojo-fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto una prueba VP positiva.

Resultados:
(+) Enterobacter aerogenes
(-)Escherichia coli
PSEUDOMONA SPP.
Familia: ENTEROBACTER
Tinción: GRAM –
Forma: BACILOS CORTOS, CURVADOS O RECTOS
Movilidad: POSEE FLAGELOS POLARES

SALMONELLA
Familia: ENTEROBACTER
Tinción: GRAM –
Forma: BACILOS CORTOS
Movilidad: FLAGELOS PERÍTRICOS
SHIGUELLA SPP.
Familia: ENTEROBACTER
Tinción: GRAM –
Forma: BASTONCILLOS

ESCHERICHIA COLI
Familia: ENTEROBACTER
Tinción: GRAM –
Forma: BACILOS CORTOS NO ESPORULADOS .
Movilidad: FLAGELOS PERÍTRICOS

STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Familia: MICROCACEAE
Tinción: GRAM +.
Forma: COCACEA
Agar Triple Hierro-Triple Azúcar (Agar TSI o Triple Sugar Iron).
Este medio se emplea para detectar la fermentación de lactosa, sacarosa y glucosa, con formación de ácido y gas y, también para detectar la producción de ácido sulfhídrico.

Agar Hierro Lisina (Agar LIA o Lisyne Iron Agar).
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo.
Medio Movilidad-Indol-Ornitina (Medio MIO o Motility Indole Ornithine Médium).
Se emplea para determinar la movilidad, presencia de una actividad de la enzima ornitina decarboxilasa y, la producción de indol.

Agar Citrato de Simmons (Simmons Citrate Agar).
Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio

Agar SIM (Sulfide Indole Motility Medium).
Medio que permite poner en evidencia la producción de indol, ácido sulfhídrico y movilidad de las bacterias.

Catalasa.
Esta prueba sirve para comprobar la presencia de la enzima catalasa en preparaciones de microorganismos.
Caldo RM – VP (Methyl Red and Voges Proskauer Test).
Con estas dos pruebas se estudia qué tipo de fermentación (butilenglicólica o ácido mixta) realiza el microorganismo en estudio.
La prueba de Voges-Proskauer sirve para comprobar la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro, el acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir de la fermentación (butilenglicólica) de la glucosa. La prueba del rojo de metilo sirve para comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación (ácido mixta) de la glucosa.

Caldo Lactosa Rojo de Fenol (CLRF o Phenol Red Lactose Broth).
Este medio permite evidenciar la presencia de bacterias fermentadoras del azúcar lactosa.
Medio de carbono.
Presencia o ausencia de oxigeno.
Atmósfera adecuada.

Agar-agar. Para un cultivo adecuado de bacterias y microorganismos, se utiliza el agar, un gel coloidal formado por hidratos de carbono, de extendido uso comercial, y que proviene de las paredes celulares de varias especies de algas rojas, en concreto de miembros orientales del género Gelidium. Se utiliza como agente solidificante en la preparación de dulces, cremas y lociones, así como en las conservas de pescado y carne; para texturizar y emulsionar los helados y postres congelados; para clarificar, durante el proceso de fabricación del vino y la elaboración de la cerveza; y también para dar apresto (almidonar) las telas. Además, es un excelente medio de cultivo de bacterias, ya que no se disuelve por el efecto de las sales, ni se consume por la acción de la mayoría de los microorganismos

El agar se extrae de las algas marinas haciéndolas hervir. Posteriormente, el producto resultante se deja enfriar y secar, y al final se solidifica en pastillas o en escamas. En un principio se llamó agar-agar, un término que se utiliza en Malasia para denominar a un alga local.
Pero existen diferentes tipos de agar de acuerdo a las especificidades que cada uno tenga, sin embargo cada tipo de agar debe de cumplir con los requerimientos:

Fuente de energía.- Las bacterias pueden ser fotótrofas o quimiotótrofas. Las fototótrofas absorben energía del sol y las quimiotótrofas de compuestos orgánicos.

Fuente de carbono.
Fuente de nitrógeno.- Las bacterias pueden obtener el nitrógeno atmosférico a través de las proteínas o por la degradación de aminoácidos o péptidos.
Azufre y fosfatos.- La obtienen como elemento(S), y como fosfatos en sales (P).
 Vitaminas.

Agua.- Medio de transporte que permite una mejor absorción de los nutrimentos.También requiere de los requerimientos nutricionales óptimos para su desarrollo:

Proteínas.- Se suministran generalmente peptonas, que se encuentran disponibles en el comercio, preparadas por digestión parcial de carne con enzimas peptídicas; consisten en polipéptidos, dipéptidos y aminoácidos.
Carbohidratos.- Sumistran carbono para la síntesis, y además su fermentación libera energía utilizable en el metabolismo

Medios diferenciales.- Son medios a los que se les han agregado ciertos que reaccionan con un tipo específico de bacterias. Ejem: Agar de McConckey, Agar EMB, Agar XLD.

Medios de enriquecimiento.- Son los medios que contienen alguna sustancia inhibidora por lo que se crea un medio favorable para límites mas estrechos de bacterias. Ejem: Agar S.S., Agar de Lowensten-Jensen.

Medios especiales.- Son los medios para comprobar una o más caracteríziticas bioquímicas. Ejem: Agar TSI, Agar CIT, Agar LIA, Agar MIO.

Medios inclinados.- Este tipo de cultivo es empleado principalmente para resembrar cepas aisladas, sea para identificación interior o para base cultivo.

Cultivos por agitación.- Este medio de cultivo es empleado particularmente en el aislamiento de anaerobios esporulado. Se calienta un tubo o botella a 50°C y luego se deja enfriar.

Cultivos por picadura.- En este método el material de laboratorio es colocado en un alambre recto e introducido al medio. El método puede ser también empleado para conservar los cultivos patrón.

Cultivos líquidos.- Al inocular en un medio líquido como el agua con peptona o el caldo con tioglicolato, el tubo se inclina y el material se extrae del asa por frotamiento contra la pared del tubo.
De acuerdo a las especifidades de cada medio pueden clasificarse en:

Medios básicos.- Son los medios más simples, contienen extracto de carne, peptona, sal y agua. El extracto o infusión de carne proporciona aminoácidos, vitaminas, sales y pequeñas cantidades de elementos como C, N y otros elementos. Ejem: Agar de infusión, Agar cerebro-corazón.

Medios enriquecidos.- Son aquellos medios básicos que han sido complementados con líquidos corporales, vitaminas específicas, aminoácidos, proteínas y otros nutrientes. Ejem: Agar sangre y agar chocolate.

Medios selectivos.- Son medios de agar básico, enriquecidos agregándole ciertos reactivos que impiden el crecimiento de la mayoría de las bacterias y permitiendo el desarrollo de unas cuantas. Ejem: Agar con sangre y bilis al 40%, Agar sal y manitol.







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