pruebas bioquimicas, medios de cultivo- agar tetrationato caldo

CBTIS 155

INTEGRANTES:
•Acosta Flores Iván Ulises
•Castillo Villarreal Cesar Manuel
•García Segura Erik Guadalupe
•Morgado Ramírez Alejandra
•Ponce Sánchez Erika
•Yepiz Quezada Arturo Adrián

Grupo: 4L2M

Mesa: No. 6
•
•Materia: Procesar Cultivos Bacteriológicos

•Profesor: Víctor Manuel Alfaro López


Fecha: 26 de Abril del 2010

OBJETIVO
Elaboración de un medio de cultivo especial para su uso en pruebas bioquímicas y de un medio de cultivo simple para el cultivo de bacterias de poca exigencia.

INTRODUCCION
Tetrationato Caldo.
Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp. a partir de heces, orina, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.

Fundamento
El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe metabolitos tóxicos.
La selectividad está dada por la presencia de tiosulfato de sodio, Tetrationato (generado en el medio por el agregado de la solución iodo-iodurada) y sales biliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima Tetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la flora acompañante.
Nutritivo agar

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos.
Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas.

Fundamento
Por las características de sus componentes es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.
Enterobacterias:

Son bacterias gram negativas, la mayoría bacilos, otros cocobacilos y otros pleomórficos.

No son exigentes, son de fácil cultivo.

Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa positivo), es decir, carecen de la enzima citocromo oxidasa.1

Son capaces de reducir nitrato en nitrito.

Son anaeróbicos facultativos.

Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaeróbicas con o sin la producción de gas (en especial glucosa y lactosa), y oxidadores de una amplia gama de substratos en condiciones aeróbicas.2
Muchos géneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos géneros no son móviles.

Adicional a ello, las Enterobacteriaceae no forman esporas, algunas producen toxinas y pueden ser encapsuladas y son organismos catalasa positivos.

ELABORACION DE MEDIOS DE CULTIVO

EQUIPO DE BIOSEGURIDAD:
Guantes
Gorro
Cubre bocas
Bata

MATERIALES DE CRISTALERIA:
Matraz erlenmeyer de 200ml
Vidrio de reloj
Varilla de cristal
Vaso de precipitado 50ml
Cajas petri (6)
Tubos de ensaye (10)

EQUIPO DE APOYO:
Autoclave
Estufa
Espátula
Torundas
Papel secante
Masquintape
Papel para cubrir mesa
Mecheros de bunsen (2)
Gradilla y balanza granataria.

REACTIVO:
Medio de cultivo (agar nutritivo y tetrationato de caldo)
Agua destilada
Gas LP

AGAR NUTRITIVO

PROCEDIMIENTO:
Se lavaron todos los materiales antes de hacer uso de ellos.
Se realizaron los cálculos con la regla de 3
REGLA DE 3:
Agar nutritivo…. 23gr
Agua destilada… 50ml
Regla de 3: ……..1.15gr
Vidrio de reloj…...17.4gr

46gr………1000ml
X…………..50 ml
50x46: 2300 entre 1000: 2.3gr

Se peso el vidrio de reloj (17.4gr) y se le sumo (2.3) regla de 3, el total (18.5gr) se marco la cantidad en la balanza granataria y se procedió a vaciar el polvo en el vidrio de reloj hasta anivelarlo.

El polvo fue vaciado del vidrio de reloj al matraz erlenmeyer que contenía 50 ml de agua destilada, se procedió a mezclar con la varilla de cristal hasta no dejar grumos.
El medio ya en estado líquido se paso al fuego directo hasta que este llegue al punto de ebullición.
Una ves que llego al estado de ebullición se dejo reposar 1min.
Después taponeamos el medio con torundas de algodón, una gasa, después se metió a la autoclave para esterilizar el medio y se dejo ahí durante 15 – 20 min. a 15 libras de presión, una vez esterilizado el medio se dejo reposar unos minutos, después procedimos a vaciar el medio a las cajas petri 20ml en cada caja petri, una vez vaciado el medio en las cajas esperamos a que el medio se solidificara para poder taparlas, una vez solidificado el medio etiquetamos las cajas con: nombre del medio de cultivo, numero de mesa, grupo y fecha.



ETIQUETADO:


VACIADO:

AGAR TETRATIONATO DE CALDO

PROCEDIMIENTO:
Se lavaron todos los materiales antes de hacer uso de ellos.
Se realizaron los cálculos con la regla de 3
REGLA DE 3:
Agar Tetrationato De Caldo….46gr
Agua destilada… ……………….50ml
Regla de 3: ……………………..2.3gr
Vidrio de reloj…........................17.4gr

46gr………1000ml
X…………..50 ml
50x46: 2300 entre 1000: 2.3gr

Se peso el vidrio de reloj (17.4gr) y se le sumo (2.3) regla de 3, el total (19.7gr) se marco la cantidad en la balanza granataria y se procedió a vaciar el polvo en el vidrio de reloj hasta anivelarlo.
El polvo fue vaciado del vidrio de reloj al matraz erlenmeyer que contenía 50 ml de agua destilada, se procedió a mezclar con la varilla de cristal hasta no dejar grumos.
El medio ya en estado líquido se paso al fuego directo hasta que este llegue al punto de ebullición.
Una ves que llego al estado de ebullición se dejo reposar 1min.
Se dejo reposar unos minutos, hasta que se enfriara para después poderlo vaciar a los tubos de cristal 10ml en cada tubo, después de haber vaciado el medio a los tubos de cristal se taponearon lo tubos con torundas de algodón y se juntaron los tubos y los etiquetamos con masquen tape con: el no. De mesa, grupo. Y por ultimo pusimos masquen tape alrededor de los tubos para que no se movieran.

Estufa del laboratorio

Medios vaciados y etiquetados.

Conclusion.
Los medios de cultivo quedaron en sus respectivos resipientes para hacer uso de ellos en el momento que se requiera.

ENTEROBACTERIAS

Tipos de infección: Si en microorganismo infectarte permanece en determinada zona del organismo, como en el caso de abscesos, se habla de una infección LOCAL. Y si aparece por distintas regiones del cuerpo se dice que es GENERAL.

Infección primaria: cuando se debe a una sola especie de microorganismos.

Infección mixta: cuando es de dos o más gérmenes

Infección secundaria: cuando la infección primaria es seguida por la invasión de otros microorganismos de diferentes especies.Cuando una bacteria pasa al torrente sanguíneo circulatorio sin llegar a multiplicarse en el se habla de bacteriemia, si lo hace se denomina septicemia.  

• Y si son gérmenes piogénicos que van a instalarse desde un foco local a otro sitio originando nuevos abscesos se denomina Piemia.
• Los focos creados a distancia se conocen como metastáticos.
• Se llama toxemia cuando las toxinas son absorbidas y causan trastornos.
• Se le llama sapremia cuando los productos tóxicos  tienen su origen en la descomposición de tejidos muertos por acción de bacterias saprofiticas.

Los periodos de enfermedad infecciosa son:

• INCUBACIÓN: Comprende el tiempo de entrada transcurrido de los microorganismos en el cuerpo hasta la aparición de los síntomas.
• PRODRÓMICO: Sigue al de la incubación con manifestaciones generales.
• INVASIÓN: Donde la enfermedad alcanza su completo desarrollo.
• DECLINACIÓN: Cuando los síntomas empiezan a ceder y que puede ser en crisis (pocas horas) o en lisis (algunos días).

Sistemas de defensa del organismo:

Glándulas lagrimales:

• Producen y secretan las lagrimas, las cuales constituyen una importante defensa a nivel ocular, ya sea actuando en forma directa a través de sus enzimas o bien por medio de un proceso mecánico de barrido de gérmenes y cuerpos extraños. Amígdalas y adenoides: estas estructuras,  formadas por tejido linfático, brindan protección a nivel de Producen y secretan las lagrimas, las cuales constituyen una importante defensa a nivel ocular, ya sea actuando en forma directa a través de sus enzimas o bien por medio de un proceso mecánico de barrido de gérmenes y cuerpos extraños. Amígdalas y adenoides: estas estructuras,  formadas por tejido linfático, brindan protección a nivel de fauces y fosas nasales, actuando como una importantes barrera inmunológica al impedir la proliferación de microorganismos que ingresan por vía respiratoria  u oral. 

Ganglios linfáticos y bazo:

• GANGLIOS LIFATICOS: Son formaciones ovaladas distribuidas habitualmente a nivel de los puntos de bifurcación de los conductos linfáticos. Están compuestos por tejido encargado de reconocer las partículas extrañas y poner en marcha los mecanismos necesarios para su eliminación.
• BAZO: Es un órgano vascular, cápsula do, que forma parte del sistema reticuloendotelial. Este constituido por la corteza, infiltrada por linfocitos, y la médula que contiene células linfoides. Esta estructura capta antígenos transportados por la sangre y también está encargada de la eliminación de sustancias toxicas.

Intestino grueso y la Piel

• En la luz de este órgano proliferan bacterias saprofitas que inhiben en muchas ocasiones la localización de microorganismos patógenos, capaces de producir infecciones no sólo a nivel intestinal sino también en otros órganos a partir de su diseminación.

LA PIEL

• Debido a que la piel cubre la superficie del cuerpo, es posible aseverar que este tejido representa la primera barrera de defensa contra la agresión del medio externo. Sobre esta estructura coexisten una gran variedad de gérmenes, los que ante la integridad de la misma no afectan el estado normal del individuo, pero ante determinadas situaciones en las que dicha barrera se altera, pueden actuar como organismos oportunistas modificando el estado de equilibrio.  

Transmisión de microorganismos:
Puede ser directa o indirectamente, de individuos y animales enfermos o portadores de microorganismos, así como tener su origen en gérmenes que naturalmente habitan en el cuerpo o que se introducen como resultado de heridas, inhalación etc.

• 1.-Contacto directo:
• Contacto entre personas: Sífilis, Blenorragia, Herpes Simple.
• Gotitas Expelidas al toser: Tos ferina, Sarampión y Parotiditis.
• Transmitidas por animales: Rabia, Tularemia, Carbunco.
•  
• 2.- Contacto indirecto:
• Por agua y alimentos: Fiebre Tifoidea, Paratifoidea y Disentería Bacilar.
• Por la leche: Brucelosis, Tuberculosis Bovina.
• Objetos o fómites: (Toallas, Juguetes, Sabanas) Difteria y Meningitis Meningococica.
•  
• 3.- A trabes de insectos vectores:
• Moscas: (Transportación Mecánica)  Fiebre Tifoidea, Disentería Bacilar.
• Mosquitos (El virus se multiplica en su interior, pero no pasa a los descendientes): Fiebre Amarilla y Varias Encefalitis Virosicas.
• Pulgas (El germen se multiplica en ellas) Peste Bubónica y Tifus Endémico.
• Garrapatas (Hay pasaje Transovarico) Fiebre de las Montañas Rocosas y Fiebre Botonosa.
• 4. - De origen endógeno:
• Procesos diversos por el Bacilo Coli y por cocos grampositivos que habitan en la garganta y en la piel.
• 5.- Por punciones, Heridas etc.: Tétanos y Gangrena Gaseosa.
• 6.- Por el polvo infectado: Fiebre Q. E Histoplasmosis.
• 7.- Cuando el germen infectarte tiene su origen fuera del cuerpo se dice que la infección es exógena.
• 8.- Cuando la infección es debida a microorganismos que parasitan el organismo son infecciones endógenas
• Puerta de entrada:
• Se denomina así a la vía que utilizan los agentes infecciosos para entrar en el organismo y que condiciona la capacidad infecciosa de los mismos, al permitirle su llegada a las células o tejidos que le son afines.
• PIEL: Son contados los gérmenes capaces de atravesar la piel intacta como es el de la Tularemia y de la enfermedad de Weil ( Leptospirosis) 
• Otros como el ESTAFILOCOCO, penetran en los folículos pilosos y glándulas sudoríparas para alcanzar tejidos más profundos.
• Cuando hay lesión de continuidad en la piel (abrasiones, laceraciones, cortadas.) son muchos los microorganismos que se introducen por esta vía una infección focal, o propagándose a otras partes del cuerpo.

• APARATO DIGESTIVO: Tienen entrada por esta vía las bacterias que causan las fiebres Tifoidea y Paratifoidea y la disentería Bacilar, que penetran con los alimentos y bebidas.
• APARATO RESPIRATORIO: Es la puerta de distintos agentes de neumonía tuberculosis y Aspergilosis.
• TRACTO GENITAL: Enfermedades Venéreas, Verruga Genital.
• Flora Normal: Comprende numerosos microorganismos que habitan de una manera más o menos permanente en el organismo y otra más restringida que es de carácter transitorio.

• FLORA Normal de la Piel: Se distinguen una transitoria y otra más o menos permanente, cuyo número y diversidad dependen del cuidado personal y ambiente; por lo común se encuentran:

ú  Estafilococos blancos

ú  Sarcinas

ú  Difteroides

ú  Bacilos esporulados

ú  Levaduras (cándida albicans

• En forma Transitoria pueden encontrarse:
• Estafilococos Piógenos que han sido llevados por las manos desde la nariz hasta la piel.
• Flora Normal del aparato Respiratorio:
• NARIZ: Estafilococos y Difteroides
• RINOFARINGE: Estreptococos no Hemolíticos y Diplococos Gramnegativos. En ella se sitúa un gran numero de bacterias patógenas (portadores sanos o convalecientes) como:
• Estreptococos Pneumoniae
• Neisseria Meningitides
• Streptococus Pyogenes
• Klebsiella Pneumoniae
• Haemophilus Influenzae

•  FLORA NORMAL DEL APARATO DIGESTIVO:
• BOCA: Se encuentran diferentes clases de hongos y bacterias, comúnmente en encías, espacios interdentales y criptas amigdalinas pero en general la flora del aparato digestivo esta formada por:
• Estafilococos
• Estreptococos
• Bacilos Grampositivos
• Bacilos Fusiformes y Espiroqueta que junto a los anteriores forman el grupo sinérgico Fusoespiroquetal etc.
• ESTOMAGO: Esta libre de gérmenes los que llegan ingeridos con alimentos, bebidas, y secreciones de la garganta son destruidos por el jugo gástrico.
• INTESTINO: Sus primeras porciones se pueden considerar estériles.
• INTESTINO GRUESO: Enterococos. Estafilococos, Gérmenes Aerobios Esporulados (diversos tipos de Clostridium entre ellos C. Tetan) Lactobacilos, Bacilo Coli, y otras especies de la familia Enterobacteriaceae.

• Entre los hongos se encuentran: Cándida, Triptococus, Penicillum, Aspergillus, y Geotrichum
• La flora intestinal de los recién nacidos consiste en su mayor parte de Bifidobacterium (Lactobacillus  Bifidum Si son amamantados) o de Lactobacillus Acidophilus junto a bacilos coniformes, Enterococos, Bacilos Aerobios y Anaerobios si son alimentados con biberón.

 

pruebas bioquimicas

*Fermentan con producción de ácido y gas, la lactosa y un gran número de hidrocarbonatos.
*
Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.
*
Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.

*Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de multiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio

Inoculación de pruebas bioquímicas: apartir de un cultivo fresco de la cepa bacteriana (18 – 24 hrs.) se toma una muestra de una colonia con un asa en punta y se procede a inocular diversos medios de cultivo sólido de acuerdo al protocolo específico establecido para cada ensayo experimental.

En el caso de las pruebas bioquímicas de tipo líquido (caldo rojo de metilo y caldo lactosa rojo de fenol), estas se inoculan a partir de un cultivo bacteriano en caldo.


Incubación de las muestras: todos los tubos de ensayo inoculados seincuban a 37ºC por tiempos variables, dependiendo de la especificación de cada uno de los test bioquímicos utilizados.

Ejemplo de inoculación en medio sólido:

La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.
 Procedimiento:
Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.
 Resultados:
 (+)Klebsiella spp.
 ( - ) Escherichia Coli.

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.
 Procedimiento:

Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.
 Resultados:
 (+) Escherichia coli
 ( - ) Klebsiella pneumoniae

Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.
 Procedimiento:

Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.
Resultados:

En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.
 Procedimiento:
 Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un color rojo-fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto una prueba VP positiva.

Resultados:
(+) Enterobacter aerogenes
(-)Escherichia coli
PSEUDOMONA SPP.
Familia: ENTEROBACTER
Tinción: GRAM –
Forma: BACILOS CORTOS, CURVADOS O RECTOS
Movilidad: POSEE FLAGELOS POLARES

SALMONELLA
Familia: ENTEROBACTER
Tinción: GRAM –
Forma: BACILOS CORTOS
Movilidad: FLAGELOS PERÍTRICOS
SHIGUELLA SPP.
Familia: ENTEROBACTER
Tinción: GRAM –
Forma: BASTONCILLOS

ESCHERICHIA COLI
Familia: ENTEROBACTER
Tinción: GRAM –
Forma: BACILOS CORTOS NO ESPORULADOS .
Movilidad: FLAGELOS PERÍTRICOS

STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Familia: MICROCACEAE
Tinción: GRAM +.
Forma: COCACEA
Agar Triple Hierro-Triple Azúcar (Agar TSI o Triple Sugar Iron).
Este medio se emplea para detectar la fermentación de lactosa, sacarosa y glucosa, con formación de ácido y gas y, también para detectar la producción de ácido sulfhídrico.

Agar Hierro Lisina (Agar LIA o Lisyne Iron Agar).
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo.
Medio Movilidad-Indol-Ornitina (Medio MIO o Motility Indole Ornithine Médium).
Se emplea para determinar la movilidad, presencia de una actividad de la enzima ornitina decarboxilasa y, la producción de indol.

Agar Citrato de Simmons (Simmons Citrate Agar).
Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio

Agar SIM (Sulfide Indole Motility Medium).
Medio que permite poner en evidencia la producción de indol, ácido sulfhídrico y movilidad de las bacterias.

Catalasa.
Esta prueba sirve para comprobar la presencia de la enzima catalasa en preparaciones de microorganismos.
Caldo RM – VP (Methyl Red and Voges Proskauer Test).
Con estas dos pruebas se estudia qué tipo de fermentación (butilenglicólica o ácido mixta) realiza el microorganismo en estudio.
La prueba de Voges-Proskauer sirve para comprobar la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro, el acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir de la fermentación (butilenglicólica) de la glucosa. La prueba del rojo de metilo sirve para comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación (ácido mixta) de la glucosa.

Caldo Lactosa Rojo de Fenol (CLRF o Phenol Red Lactose Broth).
Este medio permite evidenciar la presencia de bacterias fermentadoras del azúcar lactosa.
Medio de carbono.
Presencia o ausencia de oxigeno.
Atmósfera adecuada.

Agar-agar. Para un cultivo adecuado de bacterias y microorganismos, se utiliza el agar, un gel coloidal formado por hidratos de carbono, de extendido uso comercial, y que proviene de las paredes celulares de varias especies de algas rojas, en concreto de miembros orientales del género Gelidium. Se utiliza como agente solidificante en la preparación de dulces, cremas y lociones, así como en las conservas de pescado y carne; para texturizar y emulsionar los helados y postres congelados; para clarificar, durante el proceso de fabricación del vino y la elaboración de la cerveza; y también para dar apresto (almidonar) las telas. Además, es un excelente medio de cultivo de bacterias, ya que no se disuelve por el efecto de las sales, ni se consume por la acción de la mayoría de los microorganismos

El agar se extrae de las algas marinas haciéndolas hervir. Posteriormente, el producto resultante se deja enfriar y secar, y al final se solidifica en pastillas o en escamas. En un principio se llamó agar-agar, un término que se utiliza en Malasia para denominar a un alga local.
Pero existen diferentes tipos de agar de acuerdo a las especificidades que cada uno tenga, sin embargo cada tipo de agar debe de cumplir con los requerimientos:

Fuente de energía.- Las bacterias pueden ser fotótrofas o quimiotótrofas. Las fototótrofas absorben energía del sol y las quimiotótrofas de compuestos orgánicos.

Fuente de carbono.
Fuente de nitrógeno.- Las bacterias pueden obtener el nitrógeno atmosférico a través de las proteínas o por la degradación de aminoácidos o péptidos.
Azufre y fosfatos.- La obtienen como elemento(S), y como fosfatos en sales (P).
 Vitaminas.

Agua.- Medio de transporte que permite una mejor absorción de los nutrimentos.También requiere de los requerimientos nutricionales óptimos para su desarrollo:

Proteínas.- Se suministran generalmente peptonas, que se encuentran disponibles en el comercio, preparadas por digestión parcial de carne con enzimas peptídicas; consisten en polipéptidos, dipéptidos y aminoácidos.
Carbohidratos.- Sumistran carbono para la síntesis, y además su fermentación libera energía utilizable en el metabolismo

Medios diferenciales.- Son medios a los que se les han agregado ciertos que reaccionan con un tipo específico de bacterias. Ejem: Agar de McConckey, Agar EMB, Agar XLD.

Medios de enriquecimiento.- Son los medios que contienen alguna sustancia inhibidora por lo que se crea un medio favorable para límites mas estrechos de bacterias. Ejem: Agar S.S., Agar de Lowensten-Jensen.

Medios especiales.- Son los medios para comprobar una o más caracteríziticas bioquímicas. Ejem: Agar TSI, Agar CIT, Agar LIA, Agar MIO.

Medios inclinados.- Este tipo de cultivo es empleado principalmente para resembrar cepas aisladas, sea para identificación interior o para base cultivo.

Cultivos por agitación.- Este medio de cultivo es empleado particularmente en el aislamiento de anaerobios esporulado. Se calienta un tubo o botella a 50°C y luego se deja enfriar.

Cultivos por picadura.- En este método el material de laboratorio es colocado en un alambre recto e introducido al medio. El método puede ser también empleado para conservar los cultivos patrón.

Cultivos líquidos.- Al inocular en un medio líquido como el agua con peptona o el caldo con tioglicolato, el tubo se inclina y el material se extrae del asa por frotamiento contra la pared del tubo.
De acuerdo a las especifidades de cada medio pueden clasificarse en:

Medios básicos.- Son los medios más simples, contienen extracto de carne, peptona, sal y agua. El extracto o infusión de carne proporciona aminoácidos, vitaminas, sales y pequeñas cantidades de elementos como C, N y otros elementos. Ejem: Agar de infusión, Agar cerebro-corazón.

Medios enriquecidos.- Son aquellos medios básicos que han sido complementados con líquidos corporales, vitaminas específicas, aminoácidos, proteínas y otros nutrientes. Ejem: Agar sangre y agar chocolate.

Medios selectivos.- Son medios de agar básico, enriquecidos agregándole ciertos reactivos que impiden el crecimiento de la mayoría de las bacterias y permitiendo el desarrollo de unas cuantas. Ejem: Agar con sangre y bilis al 40%, Agar sal y manitol.



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



TINCIONES DIFERENCIALES

Las tinciones diferenciales son aquellas tinciones que se usan para diferenciar de manera mas explicita los microorganismos. Estas tinciones utilizan los colorantes diferenciales, que se componen de más de una sustancia tintórea. En algunas técnicas de coloración, las tinciones diferenciales más importantes que se emplean en bacteriología son las de Gram y la tinción ácido-resistente. Ambas tinciones se utilizan para obtener información acerca de la composición de las capas de la pared celular de las células bacterianas


TINCION DE GRAM

La tinción de gram o coloración de gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y bacteria gram negativa a las que se visualizan de color rosa.


Técnica :

Preparar el frotis y fijarlo al calor
Colocar la preparación fijada con la solución de cristal violeta durante l’
Lavar con solución yodada (Lugol )
Cubrir el frotis con Lugol durante 1’
Escurrir y decolorar por alcohol hasta que no arrastre más cristal violeta.
Lavar con agua
Contrastar con la solución de fucsina por 1’
Lavar con agua, secar al aire y examinar con objetivo de inmersión


BACTERIAS GRAM POSITIVAS

En microbiología, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el nombre de "Gram-positivas" o también "grampositivas". Esta característica está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como taxón se utiliza también el nombre de Posibacteria.

La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana citoplasmática y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmática mediante moléculas de ácido lipoteicoico. La capa de peptidoglucano confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tinción de Gram .

Incluyen especies tanto móviles (vía flagelos) como inmóviles con forma de bacilo (Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Lactobacillus, Listeria) o coco (Staphylococcus, Streptococcus); con gruesas paredes celulares o sin ellas (Mycoplasma). Algunas especies son fotosintéticas, pero la mayoría son heterótrofas. Muchas de estas bacterias forman endosporas en condiciones desfavorables. Realmente, no todas las bacterias del grupo son Gram positivas (no se tiñen por la aplicación de ese método), pero se incluyen aquí por su similitud molecular con otras bacterias Gram-positivas.

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas)

BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Las Bacterias Gram-Negativas son aquellas que presentan dos membranas lipídicas y entre ellas se localiza un fina pared celular compuesta fundamentalmente por peptidoglucano ( al ser fina esta pared, no se tiñe de violeta o azul en la tinción ).

Estas bacterias se tiñen de Rosa.

Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades. Los cocos Gram-negativos causan la gonorrea (Neisseria gonorrhoeae), meningitis(Neisseria meningitidis) y síntomas respiratorios (Moraxella catarrhalis), entre otros. Los bacilos Gram-negativos incluyen un gran número de especies. Algunos de ellos causan principalmente enfermedades respiratorias (Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae , Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa), enfermedades urinarias (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens) y enfermedades gastrointestinales (Helicobacter pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi). Otros están asociadas a infecciones nosocomiales (Acinetobacter baumanii).

Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram

TINCION DE Ziehl Neelsen

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis.
Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a 1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 -1894), un patólogo.

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias. Contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistente. Las mico bacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

Se ha desarrollado una coloración de ácido-alcohol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen ácidos-grasos de unos 50 átomos de carbono), de los actinomiceos (muy semejantes pero no ácido-alcohol resistentes). Nocardia spp son decoloradas por la mezcla ácido-alcohol estándar pero no por un tratamiento más suave con ácido sulfúrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes parciales o débiles.
El frotis se tiñe durante unos 5 min. con Carbol fucsina aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teñir durante 30-60 seg. Con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar

TECNICA:

Cubrir la lamina previa fijación de la preparación por calor con la fucsina fenicada de Ziehl Neelsen y calentarla hasta que emita vapores, sin que hierva, durante tres a cinco minutos, respondiendo constantemente el colorante para evitar la desecación.
Lavar con agua corriente.
Decolorar con el alcohol-ácido hasta que no haya más salida de color.
Lavar con agua corriente.
Contrateñir con la solución de azul de metileno por un minuto.
Lavar con agua, secar al aire y observar por inmersión.
Puede utilizarse en lugar de la Carbo fucsina de Ziehl – Neelsen la de Kinyoun, en cuyo caso no es necesario el calentamiento.

COMPOSICION:

Fucsina básica..... 4 g
Fenol.................... 8 ml
Alcohol etílico de 95°....................... 20 ml
Agua destilada... l00 ml
Los microorganismos pertenecientes al genero Mycobacterium son designados acidorresistentes a causa de que una vez teñidos por un método conveniente retienen el colorante y no son decolorados por acción de los ácidos. Los gérmenes acidorresistentes (bacilos de la tuberculosis y de la lepra) aparecen de color rojo y los no acidorresistentes de azul, al igual que las células, leucocitos, etc. Del material en estudio.


Imagen: BGN y levaduras en una tinción GRA Para la tinción del bacilo tuberculoso, lepra y mico bacterias

Tinciones

Tinción De Gram

La tinción de gram o coloración de gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y bacteria gram negativa a las que se visualizan de color rosa.

Técnica

• Preparar el frotis y fijarlo al calor
• Colocar la preparación fijada con la solución de cristal violeta durante l’
• Lavar con solución yodada (Lugol )
• Cubrir el frotis con Lugol durante 1’
• Escurrir y decolorar por alcohol hasta que no arrastre más cristal violeta.
• Lavar con agua
• Contrastar con la solución de fucsina por 1’
• Lavar con agua, secar al aire y examinar con objetivo de inmersión

Bacterias Gram Positivas

• En microbiología, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el nombre de "Gram-positivas" o también "grampositivas". Esta característica está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como taxón se utiliza también el nombre de Posibacteria.




• La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana citoplasmática y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmática mediante moléculas de ácido lipoteicoico. La capa de peptidoglucano confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tinción de Gram, Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).

Bacterias Gram Negativas

• Las Bacterias Gram-Negativas son aquellas que presentan dos membranas lipídicas y entre ellas se localiza un fina pared celular compuesta fundamentalmente por peptidoglucano ( al ser fina esta pared, no se tiñe de violeta o azul en la tinción ).


• Estas bacterias se tiñen de Rosa.
  
• Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades. Los cocos Gram-negativos causan la gonorrea (Neisseria gonorrhoeae), meningitis(Neisseria meningitidis) y síntomas respiratorios (Moraxella catarrhalis), entre otros. Los bacilos Gram-negativos incluyen un gran número de especies. Algunos de ellos causan principalmente enfermedades respiratorias (Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae , Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa), enfermedades urinarias (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens) y enfermedades gastrointestinales (Helicobacter pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi). Otros están asociadas a infecciones nosocomiales (Acinetobacter baumanii.


• Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram

Tinción De Ziehl Neelsen

• La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis.



• Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a 1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 -1894), un patólogo.


• Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias. Contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistente. Las mico bacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.


• Se ha desarrollado una coloración de ácido-alcohol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen ácidos-grasos de unos 50 átomos de carbono), de los actinomiceos (muy semejantes pero no ácido-alcohol resistentes). Nocardia spp son decoloradas por la mezcla ácido-alcohol estándar pero no por un tratamiento más suave con ácido sulfúrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes parciales o débiles.


• El frotis se tiñe durante unos 5 min. con Carbol fucsina aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teñir durante 30-60 seg. Con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar

Técnica

• Cubrir la lamina previa fijación de la preparación por calor con la fucsina fenicada de Ziehl Neelsen y calentarla hasta que emita vapores, sin que hierva, durante tres a cinco minutos, respondiendo constantemente el colorante para evitar la desecación.


• Lavar con agua corriente.
• Decolorar con el alcohol-ácido hasta que no haya más salida de color.
• Lavar con agua corriente.
• Contra teñir con la solución de azul de metileno por un minuto.
• Lavar con agua, secar al aire y observar por inmersión.
  
• Puede utilizarse en lugar de la Carbo fucsina de Ziehl – Neelsen la de Kinyoun, en cuyo caso no es necesario el calentamiento.

Composición :
– Fucsina básica..... 4 g
– Fenol.................... 8 ml
– Alcohol etílico de 95°....................... 20 ml
– Agua destilada... l00 ml

• Los microorganismos pertenecientes al género Mycobacterium son designados acidorresistentes a causa de que una vez teñidos por un método conveniente retienen el colorante y no son decolorados por acción de los ácidos. Los gérmenes acidorresistentes (bacilos de la tuberculosis y de la lepra) aparecen de color rojo y los no acidorresistentes de azul, al igual que las células, leucocitos, etc. Del material en estudio.

Tinciones:
— Tinción negativa o TINTA CHINA
— Tinción de AZUL DE METILENO
— Tinción WRITE

Tinción Negativa o Tinta China
La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células.

La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Tinción de Azul de Metileno
Azul de metileno
† Tinción positiva.
† Permite teñir el interior celular.
† Tiñe microorganismos procarióticos (vivos o muertos).
† Los eucarióticos sólo se tiñen si están muertos.
† Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula.

Tinción de Wright
Es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Este método tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las ricketsias localizadas dentro de la célula huéspedes. La coloración se emplea también para teñir frotis de sangre en el examen para protozoos. Se puede emplear, como variaciones, otras coloraciones como es la técnica de citoconcentración para parásitos sanguíneos, la cual tiene un bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo sedimento el parásito principal, con excepción de los trofozoitos jóvenes y el plasmodium falciparum. Este método de tinción permite también la tinción diferencial de zonas con un alto contenido de ADN, y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir perfectamente en microscopio óptico el núcleo celular, los cromosomas durante la mitosis, y en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial (kinetoplasto de algunos protozoos, como Trypanosoma). Los cromosomas pueden ser tratados con varios compuestos químicos que producen la alternancia de bandas claras y oscuras a lo largo de los cromosomas. Cada cromosoma tiene un patrón de bandas característico, permitiendo que aberraciones estructurales como borrados, duplicaciones o sutiles translocaciones sean detectadas, al igual que permite la identificación de cromosomas marcadores.